ຫຼັກການເຮັດວຽກຂອງ Liquid Chromatograph (HPLC) ແມ່ນຫຍັງ?

ໂຄຣມາຕາກຣາຂອງແຫຼວປະສິດທິພາບສູງ (HPLC) ເປັນເທັກໂນໂລຍີການແຍກ ແລະການວິເຄາະທີ່ມີປະສິດທິພາບສູງໂດຍອີງໃສ່ຫຼັກການຂອງການແບ່ງແຍກໄລຍະຂອງແຫຼວ. ມັນຖືກນໍາໃຊ້ຢ່າງກວ້າງຂວາງໃນເຄມີສາດ, ຊີວະສາດ, ຢາປົວພະຍາດ, ສະພາບແວດລ້ອມແລະຂົງເຂດອື່ນໆ. ຫນ້າທີ່ຫຼັກຂອງມັນແມ່ນເພື່ອແຍກອົງປະກອບຕ່າງໆໃນສ່ວນປະສົມທີ່ສັບສົນໂດຍຜ່ານການປະຕິບັດທາງກາຍະພາບຫຼືທາງເຄມີແລະສົມທົບກັບເຄື່ອງກວດຈັບເພື່ອບັນລຸການວິເຄາະດ້ານຄຸນນະພາບແລະປະລິມານ. ຕໍ່ໄປນີ້ແມ່ນຄໍາອະທິບາຍຈາກສາມດ້ານ: ຫຼັກການການເຮັດວຽກ, ອົງປະກອບຂອງລະບົບແລະກົນໄກການແຍກ.

1. ຫຼັກການການເຮັດວຽກ: ການແຍກໂດຍອີງໃສ່ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງຄ່າສໍາປະສິດການແຈກຢາຍ

ຫຼັກການພື້ນຖານຂອງ HPLC ແມ່ນການນໍາໃຊ້ຄວາມແຕກຕ່າງຂອງຄ່າສໍາປະສິດການແຜ່ກະຈາຍຂອງສານທີ່ແຕກຕ່າງກັນລະຫວ່າງໄລຍະ stationary ແລະໄລຍະມືຖືເພື່ອບັນລຸການແຍກສ່ວນປະສົມ. ຂະບວນການສະເພາະແມ່ນດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້:

ການຈັດສົ່ງໄລຍະມືຖື: ປັ໊ມທີ່ມີຄວາມກົດດັນສູງຈະກົດໄລຍະມືຖື (ໂດຍປົກກະຕິເປັນສ່ວນປະສົມຂອງສານລະລາຍອິນຊີແລະນ້ໍາ) ເຂົ້າໄປໃນລະບົບໃນອັດຕາການໄຫຼຄົງທີ່ເພື່ອສ້າງການໄຫຼຂອງແຫຼວທີ່ຫມັ້ນຄົງ.

ການສີດຕົວຢ່າງ: ຕົວເກັບຕົວຢ່າງອັດຕະໂນມັດ injects ຈໍານວນ TRACE ຂອງຕົວຢ່າງເຂົ້າໄປໃນໄລຍະມືຖືເພື່ອສ້າງເປັນແຖບຕົວຢ່າງ.

ການແຍກຖັນ: ຕົວຢ່າງເຂົ້າໄປໃນຖັນທີ່ມີໄລຍະມືຖື (ປະກອບດ້ວຍອະນຸພາກໄລຍະ stationary). ຄຸນສົມບັດທາງເຄມີຫຼືໂຄງສ້າງທາງກາຍະພາບຂອງໄລຍະ stationary ພົວພັນກັບອົງປະກອບຂອງຕົວຢ່າງ (ເຊັ່ນ: ການດູດຊຶມ, ການແຈກຢາຍ, ການແລກປ່ຽນ ion, ແລະອື່ນໆ), ເຮັດໃຫ້ເວລາທີ່ຢູ່ອາໄສທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງແຕ່ລະອົງປະກອບໃນຖັນ.

ການກວດຫາແລະການບັນທຶກ: ອົງປະກອບທີ່ແຍກອອກຈາກຄໍລໍາ chromatographic ໃນທາງກັບກັນ, ເຂົ້າໄປໃນເຄື່ອງກວດຈັບ (ເຊັ່ນ: ເຄື່ອງກວດຈັບແສງ ultraviolet, ເຄື່ອງກວດຈັບ spectrometer ມະຫາຊົນ, ແລະອື່ນໆ), ຖືກປ່ຽນເປັນສັນຍານໄຟຟ້າແລະບັນທຶກໄວ້ໃນ chromatograms.

2. ອົງປະກອບຂອງລະບົບ: ສີ່ໂມດູນຫຼັກເຮັດວຽກຮ່ວມກັນ

ລະບົບ HPLC ປະກອບດ້ວຍສີ່ໂມດູນທີ່ສໍາຄັນ, ແຕ່ລະຄົນເຮັດວຽກຮ່ວມກັນເພື່ອບັນລຸການແຍກປະສິດທິພາບ:

ລະບົບ້ໍາຕົ້ມ

ປັ໊ມທີ່ມີຄວາມກົດດັນສູງ: ສະຫນອງຄວາມກົດດັນທີ່ຫມັ້ນຄົງ (ປົກກະຕິແລ້ວ 1-40 MPa) ເພື່ອຮັບປະກັນອັດຕາການໄຫຼຄົງທີ່ຂອງໄລຍະມືຖືຜ່ານຖັນ. ການເຫນັງຕີງຂອງອັດຕາການໄຫຼສາມາດສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ການແຜ່ພັນຂອງແຍກຕ່າງຫາກ.

ອຸປະກອນ elution gradient: ເພີ່ມປະສິດທິພາບການແຍກຕົວຢ່າງທີ່ຊັບຊ້ອນໂດຍການປັບອົງປະກອບໄລຍະມືຖືແບບເຄື່ອນໄຫວ (ເຊັ່ນ: polarity). ຕົວຢ່າງ, ການຫັນປ່ຽນເທື່ອລະກ້າວຈາກຕົວລະລາຍທີ່ມີຂົ້ວໂລກຕ່ຳໄປສູ່ສານລະລາຍທີ່ມີຂົ້ວສູງສາມາດຫຼຸດເວລາການວິເຄາະ ແລະປັບປຸງຄວາມສົມມາດສູງສຸດ.

ລະບົບການເກັບຕົວຢ່າງ

ຕົວເກັບຕົວຢ່າງອັດຕະໂນມັດ: ຄວບຄຸມປະລິມານສີດຢ່າງຖືກຕ້ອງ (ປົກກະຕິແລ້ວ 0.1-100 μL) ເພື່ອຫຼຸດຜ່ອນຄວາມຜິດພາດຂອງມະນຸດ. ຕົວຢ່າງບາງສ່ວນສະຫນັບສະຫນູນການວິເຄາະລໍາດັບແລະສາມາດປະມວນຜົນຫຼາຍຕົວຢ່າງຢ່າງຕໍ່ເນື່ອງ.

ລະບົບແຍກ

ຖັນ Chromatographic: ອົງປະກອບຫຼັກປະກອບດ້ວຍໄລຍະ stationary (ເຊັ່ນ: silica gel matrix, ການຫຸ້ມຫໍ່ໂພລີເມີ). ຂະຫນາດຂອງອະນຸພາກ (ປົກກະຕິແລ້ວ 1.8-10 μm), ຂະຫນາດ pore ແລະການດັດແປງຫນ້າດິນຂອງໄລຍະ stationary ກໍານົດປະສິດທິພາບການແຍກ. ຕົວຕື່ມຂະຫນາດອະນຸພາກຂະຫນາດນ້ອຍສາມາດປັບປຸງປະສິດທິພາບຂອງຖັນ, ແຕ່ຕ້ອງການຄວາມກົດດັນທີ່ສູງຂຶ້ນ.

ເຕົາອົບຄໍລໍາ: ຄວບຄຸມອຸນຫະພູມຖັນ (ປົກກະຕິແລ້ວ 20-40 ℃) ຜົນກະທົບຕໍ່ການຕິດຕໍ່ພົວພັນລະຫວ່າງໄລຍະ stationary ແລະຕົວຢ່າງແລະ viscosity ຂອງໄລຍະມືຖື, ດັ່ງນັ້ນການ optimizing ເງື່ອນໄຂການແຍກ.

ລະບົບການກວດກາແລະການປະມວນຜົນຂໍ້ມູນ

ເຄື່ອງກວດຈັບ: ອີງຕາມຫຼັກການກວດພົບ, ພວກມັນແບ່ງອອກເປັນປະເພດທົ່ວໄປ (ເຊັ່ນ: ເຄື່ອງກວດຈັບການສະທ້ອນຄວາມແຕກຕ່າງ) ແລະປະເພດທີ່ເລືອກ (ເຊັ່ນ: ເຄື່ອງກວດຈັບ fluorescence). ເຄື່ອງກວດຈັບ ultraviolet ໄດ້ກາຍເປັນປະເພດທີ່ໃຊ້ທົ່ວໄປເນື່ອງຈາກຄວາມອ່ອນໄຫວສູງແລະລະດັບຄໍາຮ້ອງສະຫມັກກວ້າງ.

ຊອບແວການປະມວນຜົນຂໍ້ມູນ: ແປງສັນຍານໄຟຟ້າເປັນ chromatograms, ຄິດໄລ່ເວລາເກັບຮັກສາ, ພື້ນທີ່ສູງສຸດແລະຕົວກໍານົດການອື່ນໆ, ແລະບັນລຸການວິເຄາະປະລິມານ.

3. ກົນໄກການແຍກ: ສີ່ແບບປັບຕົວກັບຄວາມຕ້ອງການທີ່ແຕກຕ່າງກັນ

ໂຄຣມາຕາເຟດປົກກະຕິ (Normal-Phase HPLC)

ໄລຍະ stationary ແມ່ນຂົ້ວໂລກ (ເຊັ່ນ: silica gel) ແລະໄລຍະມືຖືແມ່ນບໍ່ມີຂົ້ວ (ເຊັ່ນ: n-hexane). ເຫມາະສໍາລັບການແຍກທາດປະສົມທີ່ມີຄວາມແຕກຕ່າງຂະຫນາດໃຫຍ່ໃນຂົ້ວ, ເຊັ່ນວິຕາມິນທີ່ລະລາຍໄຂມັນ.

Reverse-Phase HPLC

ໄລຍະ stationary ແມ່ນ nonpolar (ເຊັ່ນ: ລະບົບຕ່ອງໂສ້ C18) ແລະໄລຍະມືຖືເປັນຂົ້ວ (ເຊັ່ນ: methanol-water). ມັນເປັນຕົວແບບທີ່ໃຊ້ກັນຢ່າງກວ້າງຂວາງສໍາລັບການແຍກທາດປະສົມຂົ້ວໂລກປານກາງຫາທາດປະສົມທີ່ບໍ່ມີຂົ້ວໂລກເຊັ່ນຢາແລະທາດໂປຼຕີນ.

ການແລກປ່ຽນໄອອອນ HPLC

ໄລຍະ stationary ແມ່ນຄິດຄ່າບໍລິການ (ເຊັ່ນ: ກຸ່ມອາຊິດ sulfonic ຫຼືກຸ່ມ ammonium quaternary), ແລະທາດປະສົມ ionic ເຊັ່ນອາຊິດ amino ແລະ ions ອະນົງຄະທາດຖືກແຍກອອກໂດຍການດໍາເນີນການ electrostatic.

ການຍົກເວັ້ນຂະຫນາດຂອງ chromatography (Size-Exclusion HPLC)

ໄລຍະ stationary ເປັນ gel porous, ເຊິ່ງແຍກອອກຕາມຂະຫນາດໂມເລກຸນແລະເຫມາະສົມສໍາລັບການວິເຄາະການແຜ່ກະຈາຍນ້ໍາໂມເລກຸນຂອງ macromolecules (ເຊັ່ນ: ທາດໂປຼຕີນແລະໂພລີເມີ).

4. ຂໍ້ໄດ້ປຽບທາງດ້ານເຕັກນິກ ແລະ ສະຖານະການນຳໃຊ້

ຂໍ້ດີຂອງ HPLC ແມ່ນປະສິດທິພາບການແຍກສູງ, ໄລຍະເວລາການວິເຄາະສັ້ນ ແລະ ເໝາະສົມກັບທາດປະສົມທີ່ບໍ່ສະຖຽນຄວາມຮ້ອນ. ຄໍາຮ້ອງສະຫມັກຂອງມັນກວມເອົາ:

ພາກສະຫນາມຢາ: ການທົດສອບຄວາມບໍລິສຸດຂອງຢາ, ການວິເຄາະ metabolite;

ການຕິດຕາມສິ່ງແວດລ້ອມ: ການກໍານົດຂອງ hydrocarbons ທີ່ມີກິ່ນຫອມ polycyclic ແລະສານຕົກຄ້າງຂອງຢາຂ້າແມງໄມ້ໃນນ້ໍາ;

ການວິເຄາະອາຫານ: ການວິເຄາະປະລິມານຂອງສານເຕີມແຕ່ງ ແລະສານກັນບູດ;

ການຄົ້ນຄວ້າທາງຊີວະພາບ: ການແຍກແລະການເຮັດຄວາມສະອາດຂອງທາດໂປຼຕີນແລະ peptides.

ໂດຍການເພີ່ມປະສິດທິພາບຕົວກໍານົດການເຊັ່ນ: ປະເພດໄລຍະ stationary, ອົງປະກອບໄລຍະມືຖືແລະອຸນຫະພູມຖັນ, HPLC ສາມາດບັນລຸການແຍກປະສິດທິພາບຈາກສ່ວນປະສົມທີ່ງ່າຍດາຍໄປຫາຕົວຢ່າງທາງຊີວະພາບທີ່ສະລັບສັບຊ້ອນ, ເຮັດໃຫ້ມັນເປັນເຄື່ອງມືທີ່ຂາດບໍ່ໄດ້ໃນເຄມີການວິເຄາະທີ່ທັນສະໄຫມ.